衛生部臨床檢驗中心（xīn）　汪靜  郭健  陳文祥  謝潔紅  張傳寶  馬嶸  趙海艦

本文為“第（dì）一屆《中國計量》中青年優秀科技論文獎”三等獎獲獎文章之一

　　酶學測定是臨床（chuáng）檢驗的常規項目，其（qí）測定結果的不確定度評估目前在國內尚未開始。但國內酶學參考實驗室網絡已略具雛形，其主要功用之一是為酶參考物質賦值，無論是國際還是國內均要求（qiú）在給出參考（kǎo）物最佳期望值的同時（shí）給出該值的不確定度，因此，如何評估酶學參考方法（fǎ）測定結果（guǒ）的（de）不確定度就成為（wéi）一個亟待解決的問題。我們通（tōng）過詳細分析在本實驗室條件下運行國際臨床化學聯合會(IFCC)丙氨酸氨基轉移酶(ALT)參考測定方法的全部過程，參照JJF1059-1999《測量不確定度評定與表示》、JJF1135-2005《化學分析測量（liàng）不確（què）定度評定》、CNAS-GL06《化學分析中不確定度的評（píng）估指南》，對測定結果的不確定度進行試評估，希望能建立一（yī）種較為科學合理（lǐ）的酶（méi）學（xué）參考方法測定結（jié）果不確定度的評估模式。    

　　一、材料與方法

　　1.樣品（pǐn）
　　凍（dòng）幹人血（xuè）清，複溶體積5mL，在-20℃下保存。複溶采（cǎi）用（yòng）稱重法，記錄兩次稱重數據及水溫，查《1990年國際溫標（biāo）純水密度表》換算出實際複溶體積。

　　2.試劑
　　乳酸脫氫酶(LDH)購自ROCHE公司（sī），其餘試劑購自SIGMA公司。按照（zhào）IFCC 37℃ ALT參考測（cè）定方（fāng）法中的試劑配方進行試劑配製（zhì），所用天平為 級(特種準確度級)，pH計為0.1級(示（shì）值誤差≤|±0.01|)，容量（liàng）瓶為A級，溫度計（jì）準確度為±0.02℃，所（suǒ）有稱量步驟的擴（kuò）展不確定（dìng）度(k=2)均小於（yú）1.5%。

　　3.儀器
　　HITACHI U3000可（kě）見紫外分光光度計（jì）及配套比色皿溫度控製附（fù）件，D642高精度溫度計，THERMO 520A pH計，METTLER AE163電子天平，EPPENDORF移液（yè）器（qì），HAMILTON稀釋分（fèn）配器（qì）。

　　4.測定方法
　　測定原理為樣品(200μL)中的ALT催化反應試劑(2000μL)中的L-丙氨酸與（yǔ）啟動試劑(200μL)中的α-酮戊（wù）二酸，使之轉化為丙酮酸與L-穀氨酸，新生成的丙酮酸（suān）在反應試劑（jì）中的（de）LDH的催化下，被NADH還原為（wéi）乳酸，NADH同（tóng）時轉變為NAD+，由於NADH在340nm處有最大吸收，此時測定（dìng）340nm下NADH吸光度的（de）下降速（sù）率即代表樣品中ALT的活性濃度。本次（cì）實驗在1天內完（wán）成，重複測定樣品（pǐn）10次，試（shì）劑空白測定2次。將測（cè）定結（jié）果記錄後進行統計學（xué）分析。    

　　二、測（cè）量不確定度評定的結果與討論

　　1.測定結果中不（bú）確定度來源（yuán）分析（xī）
　　樣品中ALT活性濃度C由下式確定:
    
    設:，則式(1)變為
    
    式中:C——樣品中ALT活性濃（nóng）度，U/L；B_m——樣品反應速率，min^-1；B₀——試劑空（kōng）白速率，min^-1；ε——NADH在340nm下的（de）摩爾吸光係數，m²mol^-1；V_R1——反應試劑體積，2.00mL；V_R2——啟動試（shì）劑體積，0.20mL；V_s——樣品體積，0.20mL；V_Res——樣品複溶體（tǐ）積，mL；L_m——實驗比色皿實（shí）際光徑，mm。
    設，V=V₁+V₂+1，則最終得到測量的（de）數學模型為（wéi）
    
    式中:ε為常數（shù），其不確定度可忽略。因此，V_Res、L_m、V、B這4個輸入量的不確定度是測定結果C的主（zhǔ）要不確定度來源。

　　2.評定標準不確定度分量
　　(1)樣品複溶體（tǐ）積(V_Res)的標準不確定度u_VRes
    采用稱重法確定樣品複溶體積，數學模型為
    
    則有（yǒu）:
    
    因皮重mt與毛（máo）重mg是由同一（yī）台天平測量的，所以二者相關，且（qiě）相關係數r為-1。由此得到:
    u²_(mg-mt)=u²_mg+u²_mt+2ru_mgu_mt
    u²_mg=u²_mt=u²_天平=u²_偏載+u²_示值+u²_重複
    u²(mg-mt)=(u_mg+u_mt)²=(2u_天平)²
    水溫為23.86℃，因本實驗室溫度計（jì）的最大允許誤差為±0.02℃，故測溫誤差對水（shuǐ）密度的影響可忽略，水密度ρ的不確定度主要源於密度值本身的擴展不確定度（dù），本文為5×10^-3kg/m³(k=2)。表1列出了複溶體積不確定度評定時的相關數據。

表1  複溶體積不確定度評定時標準不確定度分量評定（dìng）一覽表

　　注:根據JJG1036-2008《電子天（tiān）平（píng）》檢定規程中所規定的天平重複性檢定方法，天平重複性實驗標準差按極差方法計算。本次測得數據的極差為0.05mg，測量6次，所以n=6，查表得d_n值為（wéi）2.53，計算出由（yóu）重（chóng）複性引入的標準不確定為1.98×10^-2mg。
    將數據代入式(3)，可得出樣品複溶體積:
    V_Res=4.995mL
    將數據代入式(4)，則有
    

　　(2)實驗皿光徑修（xiū）正(L_m)的標準（zhǔn）不確定度u_Lm
　　在標準皿與實驗皿中分別加入440nm下吸光度約為0.45的（de）重鉻酸鉀溶液2.00mL，測定440nm處的吸光（guāng）度，計算得出（chū）實（shí）驗皿的實際光徑。計算公式為
    
    式中:L_m——實驗皿光徑；A_m、A_s——實（shí）驗皿與標準（zhǔn）皿吸光度；L_s——標準皿光徑。
    光徑修正不確定度主要源於光度計的透射（shè）比（bǐ）準確度與標準皿光徑值的不確定度。當透射比讀數誤差為1%時，所引起的測定結（jié）果相（xiàng）對誤（wù）差()約為3%。檢定報（bào）告（gào）中給出（chū）的光度計的透射比誤差為0.2%，所引起的測定結果（guǒ）相對（duì）誤差為0.6%。由證（zhèng）書得知，標準皿光徑值的擴（kuò）展不確定度為U=(1+L_S/100)，k=2。表2中列出了光徑修正不確定度評定（dìng）的有（yǒu）關（guān）數據。

表2  光徑修正不確定度評定的相關數據

　　將表2中的數據代（dài）入下式則得到光徑修正（zhèng）的標準不確定度為
    

　　(3)反應速率(B)的標準（zhǔn）不確定度u_B
　　在180s內每（měi）20s讀取一次吸光度（dù），所得數據采用（yòng）最小二乘法，以時間（jiān）(min)為（wéi）自變量、吸光（guāng）度為因變量得出回（huí）歸方程（chéng），斜率b的值即為反應速率值，因此，u_B中包含了b的不確定度。溫度T對B的（de）影響也是不能忽略的，通常T每升高10℃，B增加0.5～1.5倍，本例取中間值1.0。由於參考方法要求T的擴展不確定度為0.1℃(k=2)，則相應的反應速率變化為1%。
    B的數學模型為
    
    式中:A——吸光（guāng）度；t——監測時間；a——回歸方程的截距；b——斜率（lǜ）。
    表3中列出斜率b的標（biāo）準不確定度（dù）評估相關數據(以一次測定（dìng）為例)。

表3  斜（xié）率b的標準不確定度評估相關數據

　　兩次試劑空白速（sù）率的標準不確定度平方分別為(原始數據從（cóng）略):
    u²_B01=u²_b01+u²T₀₁=2.69×10^-8+1.67×10^-10=2.71×10^-8min^-2
    u²_B02=u²_b02+u²_T02=3.94×10^-8+1.35×10^-10=3.95×10^-8min^-2
    代（dài）入式(5)，可得出反應（yīng）速（sù）率（lǜ）的標（biāo）準不確定度（dù）為
    

　　(4)加樣體積(V)的標（biāo）準不確定度u_V
　　由式(2)可知，加樣體積V的數學模型為
    V=V₁+V₂+1
    因有:
    故V₁與V₂間（jiān）是相關的，在進行（háng）方差合成時需計算兩者的協方差，公式為
    
    實驗過程中由（yóu）EPPENDORF加樣槍加注（zhù）樣（yàng）品0.20mL(V_s)，由（yóu）HAMILTON稀釋分配器1號與（yǔ）2號分別加（jiā）注反應（yīng）試劑2.00mL(V_R1)與啟動試劑（jì）0.20mL(V_R2)。實驗室用稱重法對加樣裝置的準確性與精密度進（jìn）行驗證，重複次（cì）數（shù）n為10，稱量均值為（wéi），加樣重複性實驗標準差為SD。則數（shù）學模型為
    
    由於已考慮了加樣（yàng）重複性，在天平稱量（liàng）不確定度中可以不考慮天平重（chóng）複性，因此
    u²_天平=u²_偏載+u²_示值
    表4與表5中列出了加樣體積標準不確定度評估的相（xiàng）關數據（jù），部分數據可參考（kǎo）表1。

 表（biǎo）4  加（jiā）樣體積標準不（bú）確定度評估相（xiàng）關數據    

 表5  重複（fù）測定結果及（jí）相應的不確定度評估參數

    由（yóu）表4中的數據（jù）可計算得出:
    

　　3.計算合成標準不（bú）確定度
　　由式(2)得出ALT活性（xìng）濃度C的合成標準不確定度為
    
    將（jiāng）前（qián）述各值代（dài）入式(6)中，得
    

　　4.計算（suàn）擴展不確定度
　　取包含因子為2，則本例（lì）ALT濃（nóng）度及其擴展不確定度為（wéi）
　　C=199.6U/L，U_C=3.2U/L(k=2)

　　5.重複測定結果的不確定度評估
　　對於在重複性條件下進行多次（cì）測定的（de）結果，其總體均值的不確定度評估應包（bāo）括單一結果的不確定度及多次測定的重複性。在進（jìn）行不確定（dìng）度評估之前應先進行異常值檢驗，將異常值（zhí）剔除後（hòu）再進行（háng）評估。異常值檢驗（yàn）可使用Grubbs法或Dixon法。
    總體均值的計算公式為，則有
    
    表（biǎo）5中為重（chóng）複測定10次（cì）的ALT濃度(已（yǐ）進行異常值檢（jiǎn）驗)及相應的不確定度評估參數（shù）。
    將數據（jù）代入式(7)，得出:
    取包含因子為2，則重複性條件（jiàn）下ALT測定均值及其擴展不確定度為
    

　　三、結論

　　在對ALT活性濃度（dù）進行不確定度評估時，如測量數學模型中輸入量間是乘積關（guān）係，則標（biāo）準不確定度分量可以采用相對（duì）方差合成的方式計算，不需求出靈（líng）敏係數；當數學模型不完全是乘積關係時，就不能采用相對標準不確定度合成的方式計算，此時必須計算靈（líng）敏係（xì）數，才能將輸入量的不（bú）確定度轉（zhuǎn）化為（wéi）輸出量的不（bú）確定度。本例中在被測量C的函數關係式中，原來輸入量之間不完全（quán）是相乘的關係，經過變換，數學模型中輸出量轉化為4個輸入（rù）量的乘積。這樣就使最終合成標準不（bú）確定度的評定簡單方便了。

　　當輸入量間相關時，要考慮相關係（xì）數。在進行本（běn）例中的樣品複溶體積(V_Res)的標準不確定（dìng）度評定時，由於皮重mt與毛重mg是用同一台天平測量的，因此它們間（jiān）是相關的，相關係數r為-1。同樣在評定加樣體積(V)的標（biāo）準不確定度時，由於V₁與V₂間是相關的，在進行方差合成時計（jì）算了兩者的協方差。
    本文中所描述的評估模式是基於本（běn）實驗室ALT測定（dìng）程序及儀器狀況（kuàng）的，其他實驗室（shì）在進（jìn）行此類評估時，應先根據具體實驗程序及硬件等（děng）情（qíng）況（kuàng）確定數學模型與不確定度來源後再進行評定。